دسترسی ژنتیکی به نورون‌های حسی قرنیه با استفاده از ویروس‌های وابسته به آدنو
بر اساس یک مطالعه آزمایشی که چندین سروتیپ ویروسی، پروموتر و نشانگر فلورسنت را با یکدیگر مقایسه کرده است، تزریق یک تا دو میکرولیتر از ویروس وابسته به آدنو (AAV) به استرومای قرنیه، باعث نشان‌دار شدن پایدار نورون‌های گانگلیون سه‌قلو در موش می‌شود که به قرنیه عصب‌دهی می‌کنند. این ویروس همچنین امکان بیان نشانگرهای ژنتیکی را در اعصاب محیطی قرنیه و زوائد عصبی واقع در ساقه مغز فراهم کرد. یافته‌ها روشی برای ردیابی نورون‌های حسی قرنیه در موش و دسترسی ژنتیکی به آن‌ها ارائه می‌کنند؛ این روش نه یک درمان بالینی است و نه شواهدی از اثربخشی درمانی در انسان به شمار می‌رود.
رشته‌های عصبی حسی قرنیه با شناسایی محرک‌های مکانیکی، حرارتی، شیمیایی و اسمزی، در حفظ تعادل سطح چشم و محافظت از آن نقش دارند. این رشته‌ها همچنین در واکنش‌هایی مانند پلک زدن و ترشح اشک مشارکت می‌کنند. بیشتر رشته‌های آوران قرنیه در انتقال پیام‌های درد نقش دارند. اختلال در پیام‌رسانی حسی قرنیه نیز با درد نوروپاتیک قرنیه، بیماری خشکی چشم و کراتوپاتی نوروتروفیک مرتبط دانسته شده است.
ردیاب‌های رتروگراد متداول می‌توانند نورون‌هایی را که به قرنیه عصب‌دهی می‌کنند مشخص کنند، اما قادر نیستند این نورون‌ها را وادار به بیان حسگرهای فلورسنت، فعال‌کننده‌های اپتوژنتیکی، گیرنده‌های کموجنتیکی، نوترکیب‌سازها یا سایر ابزارهای رمزگذاری‌شده ژنتیکی کنند. این مطالعه بررسی کرد که آیا رساندن AAV به داخل استروما می‌تواند دسترسی ژنتیکی به این سلول‌ها را فراهم کند یا خیر. پژوهشگران چند آزمایشگاه مستقل، ناقل‌های ویروسی را به استرومای قرنیه موش‌هایی با سن پنج هفته تا شش ماه تزریق کردند.
سپس گانگلیون‌های سه‌قلوی کامل و شفاف‌سازی‌شده، برش‌های گانگلیونی، نمونه‌های کامل قرنیه و برش‌های ضخیم ساقه مغز را بررسی کردند. بیشتر ارزیابی‌ها بین دو تا ۱۲ هفته پس از تزریق انجام شد، هرچند نمونه‌برداری از بافت‌ها تا ۲۲ هفته پس از تزریق نیز ادامه یافت. مجموعه ناقل‌های آزمایش‌شده شامل AAV1، AAV2-7m8، AAV2-retro، AAV6، AAV8، AAV9 و AAV-PHP.S بود که نشانگرهای eGFP، mCherry یا tdTomato را حمل می‌کردند.
پژوهشگران همچنین سازه‌های AAV2-retro بیان‌کننده آنزیم Cre را در موش‌های دارای نشانگر گزارشگر Ai14 tdTomato آزمایش کردند تا مشخص شود آیا رساندن ویروس به قرنیه می‌تواند سامانه نشان‌گذاری مبتنی بر نوترکیبی ژنتیکی را فعال کند یا خیر. در همه سازه‌های بررسی‌شده، نشان‌دار شدن نورونی عمدتاً در بخش پشتی‌ـ‌میانی گانگلیون سه‌قلو، در محدوده شاخه چشمی این عصب، متمرکز بود؛ ناحیه‌ای که با محل مورد انتظار جسم سلولی نورون‌های متصل به قرنیه مطابقت دارد. برخی ترکیب‌های ناقل و نشانگر تنها تعداد اندکی نورون را نشان‌دار کردند، در حالی که برخی دیگر به نشان‌دار شدن شمار بسیار بیشتری از نورون‌ها انجامیدند.
AAV2-retro-CAG-tdTomato از جمله ناقل‌هایی بود که بهترین عملکرد را داشت. AAV6-CAG-eGFP نیز در نمونه‌های برش‌خورده، میزان بالایی از نشان‌دار شدن را ایجاد کرد. انتخاب پروموتر و نشانگر بر قابلیت شناسایی سلول‌ها تأثیر داشت: در مقایسه‌های انجام‌شده با AAV6، پروموتر CAG عموماً در مقایسه با CMV امکان شناسایی نورون‌های بیشتری را فراهم می‌کرد و eGFP نیز در مقایسه با mCherry با ثبات بیشتری قابل شناسایی بود. در مقایسه جداگانه سروتیپ‌ها، AAV-PHP.S تعداد کمتری نورون را نشان‌دار کرد، در حالی که میزان نشان‌دار شدن با AAV9 و AAV2-retro تقریباً یکسان بود.
این یافته‌ها نشان می‌دهند که نمی‌توان ناقل‌های مختلف را در شرایط آزمایشی گوناگون جایگزین یکدیگر دانست. روش‌های آشکارسازی فلورسنت نیز بر میزان ظاهری انتقال ژن تأثیر گذاشتند. فلورسانس طبیعی tdTomato به‌راحتی در گانگلیون‌های شفاف‌سازی‌شده قابل مشاهده بود، در حالی که تقویت سیگنال با استفاده از آنتی‌بادی، شدت سیگنال eGFP را افزایش داد؛ این اثر به‌ویژه در رشته‌های آکسونی مشهود بود.
در یکی از تحلیل‌های مقایسه‌ای، پژوهشگران به‌طور متوسط ۷۴٫۳ نورون مثبت از نظر eGFP را با استفاده از فلورسانس طبیعی شناسایی کردند؛ این تعداد پس از نشان‌گذاری ایمنی با آنتی‌بادی ضد GFP به ۱۱۸٫۵ نورون رسید که تفاوتی معنادار بود. از مجموع نورون‌های شناسایی‌شده، ۵۶ درصد با هر دو روش قابل مشاهده بودند، ۴۰ درصد تنها پس از تقویت سیگنال با آنتی‌بادی شناسایی شدند و چهار درصد فقط با فلورسانس طبیعی قابل مشاهده بودند. بنابراین، مقایسه نشان می‌دهد که اتکا به فلورسانس مستقیم ویروس ممکن است به شمارش کمتر از واقع نورون‌های نشان‌دارشده منجر شود؛ این مسئله به‌ویژه هنگام استفاده از eGFP به‌عنوان نشانگر اهمیت دارد.
بررسی برش‌های گانگلیونی و نمونه‌های کامل گانگلیون که شفاف‌سازی شده بودند، در مجموع نتایج مشابهی به همراه داشت، هرچند در نمونه‌های شفاف‌سازی‌شده معمولاً سلول‌های قابل شناسایی بیشتری وجود داشت. پژوهشگران میزان نشان‌دار شدن با ناقل ویروسی را با ردیابی رتروگراد متداول از قرنیه مقایسه کردند. هنگامی که چهار هفته پس از تزریق AAV2-retro-CAG-tdTomato، آگلوتینین جوانه گندم (WGA) به قرنیه تزریق شد، جسم سلولی نورون‌های نشان‌دارشده با AAV و سلول‌های نشان‌دارشده با ردیاب، در همان ناحیه پشتی‌ـ‌میانی شاخه چشمی گانگلیون سه‌قلو قرار داشتند.
تعداد نورون‌هایی که با AAV نشان‌دار شدند، حدود ۲۰ درصد کمتر از نورون‌های شناسایی‌شده با آگلوتینین جوانه گندم بود؛ با این حال، هم‌پوشانی قابل‌توجهی میان دو جمعیت وجود داشت. اندکی بیش از نیمی از مجموع سلول‌های نشان‌دارشده، هر دو نشانگر را بیان می‌کردند، در حالی که نزدیک به یک‌سوم آن‌ها فقط با ردیاب قابل شناسایی بودند. مقایسه جداگانه با ردیاب فست بلو (Fast Blue) نیز نشان داد که بیشتر نورون‌های نشان‌دارشده با AAV، با این ردیاب هم مثبت بودند. در آن آزمایش، از ناقل عمداً رقیق‌شده استفاده شد و تعداد نورون‌های نشان‌دارشده تقریباً نصف تعداد سلول‌های شناسایی‌شده با فست بلو بود. پژوهشگران رقیق‌سازی ناقل را توضیح احتمالی این کاهش تعداد دانستند.
نتایج از وجود هم‌خوانی قابل‌توجه میان نشان‌دارسازی ویروسی و روش‌های متداول حمایت می‌کنند، اما نشان نمی‌دهند که این دو روش کاملاً معادل‌اند. بررسی نشانگرهای سلولی و اندازه‌گیری‌های آناتومیکی نیز با ویژگی‌های نورون‌های حسی قرنیه سازگار بود. حدود یک‌سوم نورون‌های نشان‌دارشده با tdTomato در سه ترکیب مختلف از سروتیپ و پروموتر، پروتئین مرتبط با ژن پپتید وابسته به ژن کلسی‌تونین (CGRP) را بیان می‌کردند؛ این پروتئین در زیرمجموعه‌ای از نورون‌های آوران قرنیه وجود دارد.
توزیع اندازه جسم سلولی نورون‌ها با حضور ترکیبی از نورون‌های دارای رشته‌های عصبی C و نورون‌های دارای رشته‌های A-دلتا سازگار بود. در موش‌هایی که نورون‌های درد‌رسان بیان‌کننده NaV1.8 در آن‌ها حذف شده بودند، هیچ نورون نشان‌دارشده با AAV6-CAG-eGFP شناسایی نشد. مجموع این مشاهدات از این برداشت حمایت می‌کند که ناقل‌ها عمدتاً به نورون‌های حسی درد‌رسان قرنیه دسترسی پیدا کرده‌اند، هرچند مشخصات کلی جمعیت سلول‌ها از نظر ایمنی‌شناختی همچنان روشن نیست.
بیان نشانگرها از جسم سلولی نورون‌ها در گانگلیون سه‌قلو به بخش‌های محیطی و مرکزی مسیر حسی نیز گسترش یافت. در نمونه‌های کامل قرنیه، نشانگرهای ویروسی در رشته‌های عصبی استروما، شبکه عصبی زیرقاعده‌ای و پایانه‌های عصبی داخل اپی‌تلیوم مشاهده شدند. میان تعداد رشته‌های مثبت از نظر نشانگر در شبکه زیرقاعده‌ای و تعداد نورون‌های نشان‌دارشده در گانگلیون ارتباط معناداری وجود داشت؛ ضریب تعیین این رابطه ۰٫۷۲ بود، با F(1,4) برابر با ۱۰٫۴ و مقدار P برابر با ۰٫۰۳.
برای پایانه‌های عصبی استرومایی یا داخل اپی‌تلیومی، رابطه معناداری مشاهده نشد. ناقل AAV2-retro در مقایسه با AAV9 و AAV-PHP.S تراکم بیشتری از اعصاب قرنیه نشان‌دارشده با tdTomato ایجاد کرد. پژوهشگران همچنین افزونه‌ای اختصاصی برای نرم‌افزار ImageJ طراحی کردند تا در تحلیل‌های کمی، رشته‌های عصبی استروما، شبکه زیرقاعده‌ای و بخش داخل اپی‌تلیومی را از یکدیگر تفکیک کنند. برای مقایسه بیان نشانگر گزارشگر با مجموع عصب‌دهی قرنیه نیز از نشان‌گذاری بتا-III توبولین استفاده شد. ردیابی مسیرهای مرکزی نشان داد که آکسون‌های نشان‌دارشده از طریق ریشه حسی شکمی‌ـ‌میانی عصب سه‌قلو وارد ساقه مغز می‌شوند و بیشتر رشته‌ها در همان سمت چشم تزریق‌شده به پایانه می‌رسند.
یک میدان انتهایی منتشر در زیرهسته اصلی پشتی عصب سه‌قلو مشاهده شد. میدان دومی در نزدیکی مرز میان زیرهسته‌های اینترپولاریس و کودالیس، در موقعیت تقریبی ۷٫۴- میلی‌متر نسبت به برگما، ظاهر شد. میدان گسترده‌تری نیز در بخش دمی‌تر، از حدود ۸٫۰- میلی‌متر نسبت به برگما، آغاز می‌شد. این میدان از بخش خلفی زیرهسته کودالیس عبور می‌کرد، به شاخ پشتی بخش فوقانی نخاع گردنی گسترش می‌یافت و تقریباً در سطح قدامی مهره گردنی دوم (C2) پایان می‌گرفت.
با ورود رشته‌های عصبی به شاخ پشتی نخاع، آن‌ها عمدتاً در لامیناهای I و II متمرکز شدند. در دو مورد از ۱۶ حیوان، زوائد عصبی پراکنده‌ای فراتر از مرز پشتی زیرهسته اصلی امتداد یافتند و به سمت بخش بسیار جانبی هسته پارابراکیال یا هسته کولیکرـ‌فوزه پیش رفتند. میدان‌های عصبی ترسیم‌شده عمدتاً با بازنمایی‌های مرکزی پیام‌های ورودی از قرنیه که در مطالعات پیشین ردیابی، تحریک و الکتروفیزیولوژی توصیف شده بودند، مطابقت داشتند. با این حال، داده‌های موش در این پژوهش، مسیرهای منتهی به زیرهسته اصلی و نیز گسترش‌های گاه‌به‌گاه رشته‌های عصبی به نواحی دورتر را نیز نشان دادند.
این روش چند محدودیت مهم دارد. اگرچه تزریق‌ها در بخش مرکزی قرنیه انجام شدند تا فاصله آن‌ها از لیمبوس، یعنی مرز میان قرنیه و صلبیه، تا حد امکان بیشتر باشد، پژوهشگران نتوانستند احتمال انتشار ناقل به سمت لیمبوس، بافت‌های اطراف قرنیه یا سایر بخش‌های مجاور را رد کنند. بیان نشانگر در این نواحی نیز به‌طور نظام‌مند بررسی نشد. بنابراین، این احتمال وجود دارد که نورون‌های عصب‌دهنده به ساختارهای مجاور قرنیه نیز در جمعیت نشان‌دارشده مشارکت داشته باشند.
عوامل مؤثر بر عملکرد روش شامل سروتیپ ویروس، پروموتر، نشانگر گزارشگر، دوز ناقل، فاصله زمانی پس از تزریق، شیوه تزریق و روش‌های آماده‌سازی بافت بودند؛ هرچند اثر متقابل همه این عوامل به‌طور آماری مشخص نشد. آزمایش‌ها فقط روی موش انجام شده‌اند و ایمنی این روش در انسان یا اثربخشی بالینی آن را اثبات نمی‌کنند. نویسندگان توصیه می‌کنند در پژوهش‌هایی که به اختصاصیت دقیق آناتومیکی نیاز دارند، از کمترین حجم مؤثر تزریق استفاده شود، اجزای ناقل با دقت انتخاب شوند و بافت‌های مجاور مستقیماً از نظر بیان نشانگر بررسی شوند.
با در نظر گرفتن این محدودیت‌ها، تزریق AAV به استرومای قرنیه بستری آزمایشی با ماندگاری بالا فراهم می‌کند که از طریق آن می‌توان نورون‌های آوران قرنیه را ردیابی کرد و به‌صورت ژنتیکی به جسم سلولی، آکسون‌های محیطی و مسیرهای مرکزی آن‌ها دسترسی یافت.
موضوع پژوهش: رساندن ویروس وابسته به آدنو برای دسترسی ژنتیکی به نورون‌های حسی قرنیه در موش
عنوان مقاله: انتقال ژن با ویروس وابسته به آدنو برای هدف‌گیری نورون‌های گانگلیون سه‌قلو که به قرنیه عصب‌دهی می‌کنند
مشخصات مقاله: Reynolds, S. S., Rasheed, M. Z., Niyonkuru, K., Parikh, S., Whyland, K., Merrill, B. M., Perez, W., Mitra, S., Zal, T., Yun, H., Davis, B., St. Leger, A. J., Matynia, A., & Meng, I. D. (2026). Adeno-associated virus gene delivery targeting corneal-projecting trigeminal ganglion neurons. Frontiers in Cellular Neuroscience, 20، مقاله 1925806. https://doi.org/10.3389/fncel.2026.1925806
شناسه دیجیتال مقاله (DOI): 10.3389/fncel.2026.1925806
کلیدواژه‌ها: ویروس وابسته به آدنو، عصب‌دهی قرنیه، گانگلیون سه‌قلو، انتقال ژن، نورون‌های حسی، ناقل ویروسی، ردیابی عصبی، استرومای قرنیه، مسیرهای عصبی ساقه مغز، پژوهش روی موش