شناسایی ساختار یک پلی‌ساکارید حاصل از ناتوی لوبیا چشم‌بلبلی و بررسی اثر آن بر مهار آلفا‌آمیلاز و اتصال به اسیدهای صفراوی
پژوهشگران چینی موفق شده‌اند یک پلی‌ساکارید همگن را از ناتوی لوبیا چشم‌بلبلی، محصولی تهیه‌شده از تخمیر این حبوبات با همان باکتری مورد استفاده در تولید ناتوی سنتی ژاپنی، جداسازی و ساختار آن را به‌طور کامل مشخص کنند. بخش خالص‌سازی‌شده که JDFE1-F نام گرفته است، نوعی آلفاگلوکان با وزن مولکولی پایین است که ستون فقرات آن عمدتاً از واحدهای خطی →4)-α-D-Glcp-(1→ تشکیل شده و تعداد محدودی شاخه در موقعیت O-6 دارد. در آزمایش‌های آزمایشگاهی، این گلوکان آنزیم آلفا‌آمیلاز، یعنی آنزیمی را که فرایند هضم نشاسته غذایی را آغاز می‌کند، مؤثرتر از پلی‌ساکاریدهای استخراج‌شده از دانه‌های تخمیرنشده لوبیا چشم‌بلبلی مهار کرد. همچنین، این ترکیب توانست مقدار قابل‌توجهی از سدیم گلیکودئوکسی‌کولات، یکی از اسیدهای صفراوی کونژوگه، را به خود متصل کند. یافته‌های این پژوهش که در مجله Food Science & Nutrition منتشر شده است، ارتباط میان ساختار مولکولی دقیق این ترکیب و ویژگی‌های عملکردی قابل‌اندازه‌گیری آن در شرایط آزمایشگاهی را نشان می‌دهد. نتایج همچنین حاکی از آن است که تخمیر و سپس خالص‌سازی می‌توانند بخش‌هایی از پلی‌ساکاریدهای حبوبات را با ویژگی‌های ساختاری و عملکردی متمایز غنی کنند.
گروه پژوهشی مستقر در دانشگاه جیانگ‌هان و مؤسسات همکار در استان هوبئی چین، کار خود را با لوبیا چشم‌بلبلی (Vigna unguiculata L.) آغاز کرد؛ حبوباتی که به ارزش غذایی، سازگاری با شرایط محیطی و نقششان در تأمین امنیت غذایی شناخته می‌شوند. دانه‌های لوبیا ابتدا شسته و خیسانده شدند، سپس تحت فرایند استریلیزاسیون قرار گرفتند و با سویه Bacillus subtilis natto (CICC 10263) تلقیح شدند. این سویه به دلیل توانایی چشمگیر در تولید ناتوکیناز انتخاب شده بود؛ میزان تولید این آنزیم در شرایط بهینه دمای ۳۷ درجه سانتی‌گراد و pH برابر با ۷٫۰، از ۵۰۰۰ واحد فیبرینولیتیک به‌ازای هر گرم (FU/g) فراتر می‌رود. سازگاری این سویه با فرایند تخمیر در شرایطی که پایداری حرارتی اهمیت دارد نیز در انتخاب آن مؤثر بود. تخمیر در حالت جامد به مدت ۲۴ ساعت و در دمای ۳۷ درجه سانتی‌گراد انجام شد. پس از آن، محصول برای رسیدن بیشتر به مدت معینی در دمای ۴ درجه سانتی‌گراد نگهداری و سپس به روش انجمادی خشک شد. در ادامه، پلی‌ساکاریدها هم از دانه‌های خام لوبیا چشم‌بلبلی و هم از محصول تخمیرشده آن استخراج شدند. برای این منظور، استخراج با آب داغ، چربی‌زدایی با اتانول، رسوب‌دهی اسیدی با اسید تری‌کلرواستیک و سپس رسوب‌دهی با اتانول انجام گرفت. عصاره‌های خام حاصل به‌ترتیب JD و JD-F نام‌گذاری شدند.
تخمیر به افزایش قابل‌اندازه‌گیری بازده استخراج پلی‌ساکاریدها منجر شد. بازده استخراج JD-F از لوبیای تخمیرشده ۶٫۱۷ ± ۰٫۳۳ درصد بود که به‌طور معناداری از مقدار ۴٫۵۵ ± ۰٫۳۴ درصد به‌دست‌آمده از دانه‌های خام بیشتر بود. پژوهشگران این افزایش را به تغییراتی نسبت می‌دهند که تخمیر در ساختار ماتریکس لوبیا ایجاد می‌کند. رشد میکروبی و ترشح آنزیم‌ها شبکه‌های دیواره سلولی گیاه را مختل می‌کند، پلی‌ساکاریدهای متصل به این شبکه‌ها را آزاد می‌سازد و برهم‌کنش پلی‌ساکاریدها با سایر اجزای درشت‌مولکولی را کاهش می‌دهد. در نتیجه، آزادسازی پلی‌ساکاریدها در مرحله استخراج بعدی آسان‌تر می‌شود. بررسی ترکیب شیمیایی نیز افزایش غلظت کربوهیدرات‌ها را تأیید کرد. نمونه JD حاوی ۳۳٫۵۸ ± ۲٫۸۲ درصد کربوهیدرات کل، ۸٫۴۷ ± ۰٫۴۳ درصد پروتئین و ۱٫۰۱ ± ۰٫۴۹ درصد اسید اورونیک بود. پس از تخمیر و استخراج اولیه، میزان کربوهیدرات کل در JD-F به ۴۴٫۰۳ ± ۲٫۱۵ درصد و میزان اسید اورونیک به ۸٫۲۲ ± ۱٫۵۴ درصد افزایش یافت، درحالی‌که پروتئین از حد تشخیص پایین‌تر رفت. این نتایج با افزایش قابلیت استخراج کربوهیدرات‌ها در اثر تخمیر و حذف پروتئین به کمک اسید تری‌کلرواستیک سازگار است.
پژوهشگران نمونه JD-F را به دلیل خلوص نسبتاً بالای پلی‌ساکاریدها، فراوانی اسید اورونیک و مقدار کم پروتئین، برای بررسی دقیق‌تر انتخاب کردند. در مرحله نخست خالص‌سازی، از کروماتوگرافی تبادل یونی با ستون DEAE-Sepharose Fast Flow استفاده شد. چهار بخش حاوی کربوهیدرات با آب مقطر و محلول‌های کلرید سدیم با غلظت‌های ۰٫۲، ۰٫۵ و ۱٫۰ مولار از ستون خارج شدند. بررسی وزن مولکولی نشان داد بخشی که با آب شسته شده بود و JDF-E1 نام داشت، عمدتاً از پلی‌ساکاریدها تشکیل شده است؛ در مقابل، بخش جداشده با محلول ۰٫۲ مولار کلرید سدیم بیشتر حاوی الیگوساکاریدها و سایر ترکیبات کربوهیدراتی با وزن مولکولی پایین بود. به همین دلیل، JDF-E1 با استفاده از کروماتوگرافی排除 اندازه یا ژل‌تراواایی روی ستون Sephacryl S-300 HR بیشتر خالص‌سازی شد و بخش همگن JDFE1-F به دست آمد. کروماتوگرافی ژل‌تراوایی با کارایی بالا، یک قله غالب پلی‌ساکاریدی را نشان داد که وزن مولکولی متوسط وزنی آن ۵٫۱۷۵ کیلو‌دالتون و شاخص پراکندگی وزن مولکولی آن ۱٫۳۶ بود. این شاخص نشان‌دهنده توزیع نسبتاً محدود وزن مولکولی است. میزان کربوهیدرات کل در JDFE1-F به ۸۵٫۱۲ ± ۳٫۰۹ درصد رسید؛ میزان اسید اورونیک ۹٫۱۶ ± ۰٫۷۷ درصد بود و پروتئینی در نمونه شناسایی نشد.
برای تعیین ساختار این ترکیب، پژوهشگران مجموعه‌ای از روش‌های مکمل را به کار گرفتند. طیف‌سنجی فروسرخ تبدیل فوریه، نوار پهنی را در عدد موج ۳۴۰۵ سانتی‌متر معکوس مربوط به ارتعاش کششی پیوند O-H، نوار کششی C-H در ۲۹۳۰ سانتی‌متر معکوس و نوار خمشی آب پیوندی را در حدود ۱۶۴۰ سانتی‌متر معکوس نشان داد. همچنین، نوارهای برجسته در ۱۱۵۴، ۱۰۸۱ و ۱۰۲۰ سانتی‌متر معکوس با ارتعاش‌های C-O-C و C-O، که از ویژگی‌های پیوندهای گلیکوزیدی و حلقه‌های پیرانوزی هستند، مطابقت داشتند. نوار جذبی در ۸۵۵ سانتی‌متر معکوس نیز که معمولاً با پیکربندی آلفاگلیکوزیدی ارتباط دارد، بر غالب‌بودن واحدهای گلوکوپیرانوز متصل‌شده از نوع آلفا دلالت داشت. بررسی ترکیب مونوساکاریدی با استفاده از کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC)، پس از هیدرولیز با اسید تری‌فلوئورواستیک و مشتق‌سازی با PMP، نشان داد که JDFE1-F پلی‌ساکاریدی غنی از گلوکز است و بیش از ۹۸ درصد ترکیب مونوساکاریدی آن را گلوکز تشکیل می‌دهد. تنها مقادیر بسیار کمی مانوز، گالاکتوز و آرابینوز نیز شناسایی شد که به‌ترتیب ۰٫۰۲۴، ۰٫۵۵۷ و ۱٫۱۹۹ درصد بودند.
در مرحله بعد، تحلیل متیلاسیون و سپس کروماتوگرافی گازی ـ طیف‌سنجی جرمی چهار نوع پیوند گلیکوزیدی را مشخص کرد: 1,4-Glcp با فراوانی ۸۱٫۰۲۳ درصد، t-Glcp با فراوانی ۱۲٫۰۰۱ درصد، 1,4,6-Glcp با فراوانی ۵٫۵۷۵ درصد و 1,5-Araf با فراوانی ۱٫۴۰۰ درصد. واحدهای 1,4-Glcp که بیشترین سهم را داشتند، ستون فقرات اصلی مولکول را تشکیل می‌دهند. واحدهای 1,4,6-Glcp که فراوانی کمتری دارند، نقاط انشعاب را ایجاد می‌کنند و شاخه‌های جانبی در موقعیت O-6 به آن‌ها متصل می‌شوند. واحدهای انتهایی گلوکز نیز انتهای شاخه‌های جانبی کوچک‌تر را می‌پوشانند.
طیف‌سنجی تشدید مغناطیسی هسته‌ای (NMR)، شامل طیف‌های یک‌بعدی ¹H و ¹³C و آزمایش‌های دوبعدی COSY، HSQC، HSQC-TOCSY، HMBC و NOESY در آب سنگین (D₂O)، این انتساب‌های ساختاری را تأیید کرد. یک سیگنال متقاطع برجسته در مختصات δ 5.24/99.35 ppm به واحد →4)-α-D-Glcp-(1→ و سیگنال دیگری در δ 5.21/99.32 ppm به واحد →4,6)-α-D-Glcp-(1→ نسبت داده شد. همبستگی‌های دوربرد HMBC و سیگنال‌های متقاطع فضایی NOESY نشان دادند که واحدهای متوالی →4)-α-D-Glcp-(1→ و →4,6)-α-D-Glcp-(1→ از طریق موقعیت O-4 به یکدیگر متصل‌اند. در واحدهای شاخه‌دار، موقعیت O-6 می‌تواند به واحدهای انتهایی α-D-Glcp-(1→ یا واحدهای →5)-α-L-Araf-(1→ متصل شود؛ گروه دوم نیز در موقعیت O-5 خود یک واحد گلوکز انتهایی دارد. افزون بر این، وجود واحدهای آلفا و بتا گلوکوپیرانوز در انتهای کاهنده مولکول از روی سیگنال‌های δ 5.05/91.73 و 4.48/95.54 ppm شناسایی شد.
پس از تعیین ساختار، گروه پژوهشی فعالیت مهارکنندگی آلفا‌آمیلاز را در سه نمونه JD، JD-F و JDFE1-F با یکدیگر مقایسه کرد. هر سه نمونه توانستند فعالیت آنزیم را به‌صورت وابسته به غلظت مهار کنند. در غلظت ۴ میلی‌گرم بر میلی‌لیتر، میزان مهار برای JD برابر با ۴۴٫۴۳ ± ۱٫۱۷ درصد، برای JD-F برابر با ۵۰٫۸۰ ± ۰٫۷۸ درصد و برای JDFE1-F برابر با ۵۲٫۵۵ ± ۱٫۳۷ درصد بود. مقادیر IC₅₀ برای JD-F و JDFE1-F به‌ترتیب ۳٫۵۰۹ ± ۰٫۳۱۱ و ۲٫۶۶۸ ± ۰٫۲۸۱ میلی‌گرم بر میلی‌لیتر محاسبه شد. هر دو مقدار به‌طور معناداری از IC₅₀ نمونه JD، برابر با ۷٫۲۸۶ ± ۰٫۹۹۲ میلی‌گرم بر میلی‌لیتر، کمتر بودند (p < 0.05). آکاربوز به‌عنوان کنترل مثبت آزمایش به کار رفت.
فعالیت بیشتر JD-F در مقایسه با JD احتمالاً ناشی از تغییراتی است که تخمیر در قابلیت استخراج و ساختار مولکولی پلی‌ساکاریدها ایجاد می‌کند؛ تغییراتی که می‌توانند شامل دگرگونی در توزیع وزن مولکولی، نسبت مونوساکاریدها، میزان شاخه‌دارشدن و دسترس‌پذیری گروه‌های عاملی باشند. کمتر بودن عددی IC₅₀ در JDFE1-F نسبت به JD-F نیز ممکن است تا حدی به خلوص بیشتر پلی‌ساکارید در نمونه خالص‌شده مربوط باشد. خالص‌سازی میزان کربوهیدرات کل را از ۴۴٫۰۳ به ۸۵٫۱۲ درصد افزایش داد؛ بنابراین، در جرم یکسان از نمونه، مقدار مؤثر پلی‌ساکارید بیشتر بود.
بااین‌حال، سازوکار مهار آلفا‌آمیلاز همچنان نیازمند تفسیر محتاطانه است. پلی‌ساکاریدها ممکن است از طریق اتصال مستقیم به آنزیم، جذب‌شدن روی سطح نشاسته یا محدودکردن تماس میان آنزیم و بستر، فعالیت آنزیم را کاهش دهند. JDFE1-F از نظر ساختاری با پلیمرهای پر‌وزن مولکولی و غنی از گروه‌های هیدروکسیل، مانند گلوکومانان کونجاک، تفاوت دارد. درباره این ترکیبات با وزن مولکولی بالا پیشنهاد شده است که افزایش گرانروی و ایجاد مانعی در اطراف گرانول‌های نشاسته، انتشار آنزیم و دسترسی آن به بستر را محدود می‌کند. با توجه به وزن مولکولی نسبتاً پایین JDFE1-F، یعنی ۵٫۱۷۵ کیلو‌دالتون، بعید است چنین مانعی سازوکار اصلی اثر آن باشد.
در عوض، ساختار غنی از گلوکز این ترکیب، با پیوندهای α-(1→4)، ممکن است به آن اجازه دهد از طریق شناسایی مشابه بستر و ایجاد پیوندهای هیدروژنی با جایگاه‌های اتصال کربوهیدرات در آنزیم آلفا‌آمیلاز برهم‌کنش کند و مانع اتصال آنزیم به بستر شود. بااین‌حال، از آنجا که گلوکان‌های دارای پیوند α-(1→4) خود نیز می‌توانند بستر آلفا‌آمیلاز باشند، نتایج فعلی مشخص نمی‌کنند که کاهش فعالیت مشاهده‌شده ناشی از مهار مستقیم آنزیم است یا رقابت با بستر جایگزین و سایر اثرات وابسته به شرایط آزمایش. بنابراین، بر اساس داده‌های موجود نمی‌توان نوع مشخصی از مهار سینتیکی را به این ترکیب نسبت داد.
توانایی اتصال به اسیدهای صفراوی با استفاده از یک روش شبیه‌سازی‌شده هضم گوارشی ارزیابی شد. در این روش، نمونه‌ها ابتدا با پپسین و پانکراتین تیمار شدند و سپس در معرض سدیم گلیکودئوکسی‌کولات یا سدیم تائورودئوکسی‌کولات قرار گرفتند. مقدار اسید صفراوی آزاد با اندازه‌گیری جذب در طول موج ۳۸۷ نانومتر، پس از آب‌گیری با اسید سولفوریک، تعیین شد. هر سه نمونه در غلظت ۴ میلی‌گرم بر میلی‌لیتر بیش از ۵۰ درصد از هر دو اسید صفراوی را به خود متصل کردند. میزان اتصال JDFE1-F به سدیم گلیکودئوکسی‌کولات ۵۸٫۰۹ ± ۲٫۵۸ درصد و به سدیم تائورودئوکسی‌کولات ۶۰٫۷۹ ± ۲٫۸۷ درصد بود.
غلظت لازم برای اتصال به ۵۰ درصد سدیم گلیکودئوکسی‌کولات در نمونه JDFE1-F برابر با ۱٫۷۱۱ ± ۰٫۵۷۴ میلی‌گرم بر میلی‌لیتر بود که به‌طور معناداری از مقدار ۳٫۴۳۱ ± ۰٫۸۹۸ میلی‌گرم بر میلی‌لیتر در نمونه JD کمتر بود (p < 0.05). بااین‌حال، تفاوت میان JDFE1-F و JD-F از نظر آماری معنادار نبود. در اتصال به سدیم تائورودئوکسی‌کولات نیز تفاوت معناداری میان سه نمونه مشاهده نشد. بنابراین، بهبود آماری تأییدشده به افزایش توانایی اتصال JDFE1-F به گلیکودئوکسی‌کولات در مقایسه با JD محدود بود و نمی‌توان آن را به افزایش عمومی اتصال به هر دو اسید صفراوی تعمیم داد. تفاوت در گروه‌های کونژوگه، توزیع بار الکتریکی، آرایش فضایی و آب‌گریزی دو اسید صفراوی ممکن است بر میزان تمایل آن‌ها به اتصال به ساختار یکسان آلفاگلوکان اثر بگذارد.
نویسندگان به چند محدودیت در پژوهش خود اشاره کرده‌اند. از آنجا که مرحله اختصاصی حذف نشاسته انجام نشد، نمی‌توان احتمال حضور آلفاگلوکان‌های مشتق از نشاسته در JDFE1-F را به‌طور کامل رد کرد. همچنین، تغییرات ساختاری ناشی از تخمیر به‌طور کامل مشخص نشدند و فعالیت مهار آلفا‌آمیلاز و توانایی اتصال به اسیدهای صفراوی صرفاً در شرایط آزمایشگاهی ارزیابی شدند. پژوهش‌های آینده باید با استفاده از مقایسه‌های ساختاری، مطالعات سازوکار اثر، آزمایش‌های هضم شبیه‌سازی‌شده و اعتبارسنجی در بدن موجود زنده، منشأ ساختاری JDFE1-F، رابطه میان ساختار و فعالیت و اهمیت فیزیولوژیک آن را روشن کنند. با وجود این محدودیت‌ها، این مطالعه دانش موجود درباره پلی‌ساکاریدهای مشتق از حبوبات را گسترش می‌دهد و مبنایی برای بررسی بیشتر گلوکان‌های حاصل از تخمیر لوبیا چشم‌بلبلی به‌عنوان ترکیبات غذایی عملکردی فراهم می‌کند. این پژوهش میان ساختار مولکولی دقیق یک ترکیب و عملکرد قابل‌اندازه‌گیری آن در آزمایشگاه ارتباط برقرار کرده است.
موضوع پژوهش: تعیین ساختار و بررسی ویژگی‌های عملکردی گلوکان حاصل از ناتوی تخمیرشده لوبیا چشم‌بلبلی در شرایط آزمایشگاهی.
عنوان مقاله: تعیین ساختار و بررسی خواص مهار آلفا‌آمیلاز و اتصال به اسیدهای صفراوی در شرایط آزمایشگاهی برای گلوکان جداسازی‌شده از ناتوی تخمیرشده لوبیا چشم‌بلبلی.
منبع مقاله: Yu, J., Xu, M., Li, H., Yan, E., Niu, H., Liu, Q., Zhang, H., & Wang, H. (2026). Structural Characterization and In Vitro α-Amylase Inhibitory and Bile Acid-Binding Properties of a Glucan Isolated From Fermented Cowpea Natto. Food Science & Nutrition, 14(10), مقاله e72456. https://doi.org/10.1002/fsn3.72456
اعتبار تصویر: تولیدشده با هوش مصنوعی.
شناسه دیجیتال مقاله (DOI): 10.1002/fsn3.72456
کلیدواژه‌ها: تعیین ساختار، بررسی آزمایشگاهی، آمیلاز، مهار آنزیمی، اسید صفراوی، اتصال، ویژگی‌ها، گلوکان، جداسازی، تخمیر.